牛骨降解菌的筛选及发酵胶原多肽钙配方的研究

时间:2019-02-11    来源:互联网    作者:小编
牛骨降解菌的筛选及发酵胶原多肽钙配方的研究
刘丽丽
[概述]:
利用畜禽骨资源的综合开发,以提高骨治疗畜禽的附加价值,本文以作为研究对象进行了分析牛骨头。诱导高胶原酶和生物降解性天然骨,它们应变适用于牛发酵骨的准备功能牛骨 - 胶原钙螯合物选自钙补充剂 - 多肽(BBCP-CA)的产品。
调查的主要内容和结果如下。
土壤和水的样品从一种骨治疗植物的骨头取出,并通过应变MBL13的用户分解骨和通过设计选择的方式选择,以产生酶(活性酶25)。
60±0。
93 U / mL)。
该菌株被鉴定为蜡状芽孢杆菌。
通过亚硝基胍(NTG)处理和紫外线照射诱导该菌株,选择具有良好遗传稳定性和高胶原酶产生的B菌株。
Cereus MBL 13?U(酶活性为36。
80±1
39 U / mL),在诱变前43酶的活性显着提高。
75%(p 0。
05)。
为了进一步提高菌株产生胶原酶和分解骨的能力,优化了菌株酶的生产条件。基于酶作为指示剂的活性,判断蔗糖是最适合生产酶10的培养基。
0 g / L,骨明胶20。
0克/升,CaCl 2 O.
50g / l,NaH 2 PO 4→2H 2 O 0。
50克/升,K 2 HPO 4 - 3 H 2 O 2。
50克/升
根据响应面方法确定最佳发酵条件:接种物大小为3%,发酵温度为37℃,pH为7。
0,发酵时间为36小时,装瓶量为25ml / 250ml Erlenmeyer烧瓶,实验最大酶活力为48。
24±0。
71 U / mL,优化前增加31。
09%

Cereus MBL 13?U株(B.产生的胶原酶)
研究了Cereus collagenasa(BCC)的分离,纯化和酶学性质。
在发酵产生酶的最佳条件下,发酵液中的分子量为38。
0±1
纯化的5kDa的BCC酶。
酶学分析表明,富含天冬氨酸,赖氨酸和丝氨酸,最佳反应温度和pH值分别为40℃和8。
0;金属离子,抑制剂和蛋白质底物对酶活性的影响表明它是一种金属蛋白酶,在I型胶原蛋白的底物中具有显着的水解作用。
对比实验已经证实,水解牛胶原蛋白的能力明显优于通常用于酶促骨水解的标准I型胶原酶和蛋白酶(p。
05),稍后确认
cereus MBL13-U是分解牛骨骼的优良菌株。
为了解牛骨应变的降解机制,讨论了BCC在牛骨胶原中的酶促动力学。
实验表明,牛骨胶原的最佳提取条件如下:用乙醚在低温下脱脂,0。
脱钙48 mol / l盐酸,骨粒径为5 mm×10 mm,提取介质为1%柠檬酸和1%胃蛋白酶结合物。通过紫外光谱(UV),傅里叶变换红外光谱(FT?IR),扫描量热法(DSC)和SDS-PAGE凝胶电泳表征差异结构的结构。I型保持三螺旋的完整结构
接下来,根据水解度(DH),确定牛胶原的BCC酶水解的实验条件为30。
0 g / ml,温度为45°C,
初始酶浓度为35%(g / 100ml)的pH为8。
0,酶水解时间为6小时,调整酶反应速率方程。
仅使用一种B物种Celeus MBL 13-U用于制备源自牛骨骼生态基因(BBCP)的多肽。结果表明,发酵可以自然地增加牛骨粉溶液中游离氨基酸的含量。使用水解度(DH)和胶原含量作为指标,并且在对比实验中,使用预处理的牛骨粉,即成骨粉末作为发酵材料。
通过分析响应面来确定最佳发酵条件:1%接种物,pH值为6。
0,骨骼添加量为30。
0g / L,发酵温度为27℃,发酵时间为42小时,最大胶原多肽含量的实验值为5。
54±0。
在0mg / ml时,胶原蛋白转化率约为43%。
为了进一步提高多肽的性能,混合菌株是目标(B.
研究发酵的牛骨粉制备Cereus MBL 13?U + Lactobacillus?Bulgaricus(Lb)BBCP。
使用胶原多肽的含量作为指标,确定最佳菌株比为MBL13-U:Lb = 1:1,并且培养基的最佳组成为蔗糖含量为10。
00克/升,牛骨的添加量为30。
00克/升
在此基础上,通过响应面法测定最佳发酵条件:接种物2%,pH 7。
发酵温度为37℃,发酵时间为48小时,最大胶原多肽含量的实验值为6。
72±0。
在0mg / ml时,胶原蛋白转化率约为52%。
结果表明,混合菌株的发酵效果优于单个菌株。
为了指导生产,构建了混合菌株发酵的动力学模型。
为了获得具有强螯合能力的BBCP,进行通过超滤膜(UF)发酵混合菌株制备的BBCP的分离。
紫外光谱法测定氨基酸组成和BBCP分析表明,发酵使骨中的胶原蛋白破碎成多肽,短肽和分子量小的氨基酸。基于膜的渗透速率(TV),4个单超滤膜(各10kDa的,6kDa,4kDa,2kDa)以20克/升的BBCP最佳性能的浓度来确定。参数:压力为0。
20 MPa?0。
在22MPa下,进料溶液的温度为30℃至35℃,并且进料溶液的pH为6℃。
0?7。
0,操作周期为50分钟至60分钟。
从UF中分离后,分子量为2kDa~4kDa的BBCP在发酵液中占优势,占总肽的59%。
71%。分子量分布和的凝胶层析的Sephadex G?在每个超滤段超滤SDS?PAGE的25表明,可以分离和纯化胶原肽。
基于超滤胶原肽,研究了BBCP-Ca的制备。钙源被确定为从牛骨钙,有机沉淀剂是无水乙醇,和胶原肽进行超滤2 kDa的?4 kDa的片段。螯合物和性能的速率是索引,和螯合过程如下测定:以钙骨4多肽的重量比例1??:1,并且pH为7。
0,多肽的浓度为40。
0g / L,螯合温度和螯合时间分别为55℃和1。
在图5h中,有机沉淀剂的无水乙醇与水的比率为8:1。
在这些条件下,钙螯合率为47。
85±2。
24%,螯合产率为77。
89±3。
32%
我们研究了制备的BBCP - Ca的物理化学性质和结构。
定性检测,成分分析,通过溶解性的测量和钙保留能力的测量被确定为BBCP钙是具有财富和多肽的多肽和钙的多肽螯合化合物。在水中具有良好的溶解性和较强的钙保留能力。的Tricine-SDS-PAGE,质谱(MS),扫描电子显微镜(SEM),UV光谱法,荧光光谱法,IR,拉曼光谱(Raman),圆二色性(CD),X射线能量谱方法(确定结构的EDS),X射线衍射(XRD),核磁共振(NMR)光谱和HPLC。结果表明,钙螯合胶原蛋白多肽的分子量为2000 Da - 3326。
尽管它在4Da之间,但它仍然含有分子量为2000Da的胶原多肽的一部分。BBCP的氨基和羧基参与与Ca 2+的配位。此外,骨骼中的钙之间可能存在一些吸附。BBCP?钙二级结构主要是含有β?折叠结构和无规卷曲结构,α-?几乎没有螺旋结构,钙和P元素丰富,由晶体结构和非晶结构的。以及含有至少5种成分的新成分螯合物。
[标题授予单位]:华中农业大学[等级]:博士[学位授予]:2010年[分类号]:TS251。
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